快速克隆基因(三)

原文:

Jan Bettgenhaeuser, Simon G. Krattinger. Rapid genecloning in cereals, Theoretical and Applied Genetics, 2018.

上一篇文章与大家分享了Positionalcloning 2.0?怎样避免在基因克隆上花费10年?随着高通量测序技术的发展,“核酸”检测手段越来越精准,百迈客自2009年成立以来,一直与大家一起目睹此过程并不断成长,基于国际先进的高通量测序平台和博士为主的研发团队,开展了对群体、转录调控、医学、基因组、微生物等研究的主体业务:

??当基因组检测不是制约基因克隆的主要问题,表型鉴定逐步演变为基因克隆的新瓶颈。

在过去几年,基因组在基因克隆方面的飞速进展,基于突变体,涌现出快速且低成本的基因定位方法。也迎来:如何在成千个突变材料中将感兴趣的表型植株挑选出来的挑战。同时,基因功能的冗余也为多倍体筛选突变体造成一定阻力,一般一个基因在植株中作用明显,突变后产生的表型差异越大,这样的会容易被鉴定。而很多重要的农艺性状,例如谷物产量,耐旱性或抗病性等属于数量性状,由很多微效位点一起加效起作用,如果表型还和环境存在互作,这些无外乎都对去寻找它们的突变体克隆基因形成了障碍。例如Lr34,Lr46和Lr68是植物中抗叶锈病相关基因,在世界大多数地方,Lr34和Lr46比Lr68有更大的表型效应,而在乌拉圭和阿根廷,Lr68表现出三者间最强的表型效应,所以在克隆Lr68时要考虑环境对表型影响。理论上,合适的环境中的表型考查,可以将目标QTL的贡献率提到最大化。

过去的十年中,测序,基因组复杂性降低,标记开发和基因组分析加速了谷物基因的克隆。同时表型检测系统也有了较快的发展,可以综合自动化控制、光学成像、图像分析及计算机技术等多种现代科学技术,表型组学研究可追踪分析基因型、环境与表型的关系?;谕枷窦际?,可在稳定一致的环境下,定量,准确,无损地获取植株表型,除了可对产量、抗性等复杂性状进行动态测量外,还可获得人工无法测量的新性状如植株密度、谷粒投影面积等,另外随着代谢组的发展,也为我们带来了形形色色的表型数据。

??基因克隆,未来何去何从?

随着谷物基因组的发布,基因组学研究最终走向后基因组时代,大米,高粱,玉米,大麦和小麦的基因组被公布,这为开发分子标记,进行图位克隆提供便利,下个目标将会是综合的分析不同种质资源间的变异,包括单核苷酸变异,拷贝数变异,和结构重组等。举个例子,2018年高质量的野生稻和栽培稻的基因组、3000份水稻重测序被公布,这是水稻中首次基于上千份品种的基因序列多样性及结构研究。类似的研究在小麦和大麦中开展,基于整个品种的变异检测,可以用于TILLING群体或MutRenSeq的测序的捕获序列设计,另外,数以千份的的重测序数据将更有利于GWAS研究,例如:Arora等选取174Ae. tauschii ssp.strangulata材料和21份Ae. tauschii ssp. tauschii材料,基于AgRenSeq的K-mer分析,成功地鉴定出了Sr33,Sr45,Sr46和SrTA1662基因。

另外,可以预期的是测序技术的读长和准确性在不久的将来会进一步改进,例如,最近拟南芥的高质量基因组公布,利用MinIONNanopore组装出包含62个contigs,N50为12.3Mb,总长为111Mb基因组且大大降低测序成本,百迈客全新引进2台ONT最高通量测序仪PromethIONNanopore结果也是杠杠的:

PromethION下机数据(部分)

注:Species:分析的物种信息;SeqNum:各个长度范围内序列的数目;SumBase:指各个长度范围内序列的总长度;N50Len:reads N50长度;N90Len:readsN90长度;MeanLen:平均reads长度;MaxLen:最长reads长度;MeanQual:质量值。

我们前期的研究主要基于孟德尔遗传定律,大多涉及的是质量性状和数量性状的主效位点,而好多重要的农艺性状如产量及花期,微效QTL及它们间的互作发挥了重要作用,当然,在前期做完QTL或GWAS研究之后,图位克隆仍是定位数量性状相关基因最好的方法。

例如,GWAS和图位克隆的组合,定位水稻中的抗性基因bsr-d1。微效基因的克隆障碍主要因为它们对表型的贡献率较小,这样基于极端表型和突变体的MutMap或MutChromSeq方法并不适合于它,后期相关基因的克隆绝大部分取决于精准的表型鉴定。

总之,在过去5年里,基因组研究的进步彻底改变了基因克隆的时速,一个全面的克隆基因的目录,以及它们功能多态性,可以大大提高基因组辅助育种的准确性。

 

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